Hipertermia magnética basada en nanopartículas de óxido de hierro como terapia antitumoral: del cultivo celular tridimensional al modelo in vivo

La hipertermia magnética es una terapia prometedora para el tratamiento localizado del cáncer. Bajo la exposición a un campo magnético alterno externo, las nanopartículas magnéticas actúan como agentes de calentamiento que inducen la muerte celular en la región tratada. La comprensión de los mecanismos moleculares implicados en el daño celular generado por este tratamiento es crucial para la aplicación exitosa de esta terapia. Para esta tesis, se prepararon nanopartículas magnéticas esféricas de 11 nm por el método de descomposición térmica, que posteriormente se recubrieron con PMAO (poli (anhídrido maleico-alt-1-octadeceno) y finalmente se funcionalizaron con glucosa. Con el objetivo de evaluar la influencia de la localización de las nanopartículas en la eficacia del tratamiento térmico, se prepararon diferentes modelos de cultivo celular tridimensional (3D) basados en geles de colágeno, tanto en la línea celular de macrófagos murinos, RAW264.7, como en la línea de células tumorales pancreáticas humanas, MIAPaca-2. En un modelo, todas las partículas se encontraban localizadas dentro de las células (Modelo In), mientras que el otro modelo, contenía partículas tanto dentro como fuera de las células (Modelo In&Out). Además, se desarrolló un modelo murino de xenoinjerto de cáncer pancreático humano basado en las células MIAPaca-2. La internalización de las nanopartículas magnéticas, así como los mecanismos de muerte celular inducidos por diferentes condiciones de tratamiento de hipertermia se evaluaron por microscopía confocal, estudios de citometría de flujo, ensayos de biología molecular, análisis histológicos, medidas magnéticas y otras técnicas de caracterización analítica. Además, se evaluó el efecto del calentamiento intracelular inducido por las nanopartículas bajo acción del campo magnético mediante simulaciones computacionales. En general, los resultados in vitro e in vivo obtenidos en esta tesis han demostrado que la terapia térmica con hipertermia magnética tiene un importante efecto en la modulación de la matriz extracelular, así como en la inducción de mecanismos de inmuno-estimulación. Fenómeno especialmente relevante en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del cáncer de páncreas. Además, las evidencias experimentales de este trabajo demostraron que las vías de muerte celular inducidas por el tratamiento con hipertermia magnética dependen del número de partículas localizadas en el interior de las células. Esto es importante para comprender los mecanismos moleculares que median la respuesta celular a esta terapia térmica. Magnetic hyperthermia is a promising therapy for the localized treatment of cancer. Under the exposure to an external alternating magnetic field, magnetic nanoparticles act as heating agents inducing cell death in the treated region. Understanding the molecular mechanisms involved in the cellular damage generated by this treatment is crucial for the successful application of this therapy. In this thesis, 11 nm spherical magnetic nanoparticles were prepared by thermal decomposition, coated with PMAO (poly (maleic anhydride-alt-1-octadecene) and functionalized with glucose. In order to evaluate the influence of the nanoparticle location in the treatment efficacy, two different three-dimensional (3D) cell culture models, based on collagen gels, were prepared both in the murine macrophage cell line, RAW264.7, as in the human pancreatic tumor cell line, MIAPaca-2. One model kept all the particles inside the cells (In Model) while the other model had particles both inside and outside the cells (In&Out Model). In addition, the xenograft murine model of human pancreatic cancer based in the MIAPaca-2 cells was developed. The magnetic nanoparticle uptake and cell death mechanisms induced by different conditions of the hyperthermia treatment were evaluated by confocal microscopy, flow cytometry studies, molecular biology assays, histological analysis, magnetic measurements and other analytical characterization techniques. In addition, computational simulations to evaluate the intracellular heating effects were also performed. In general, the in vitro and in vivo results obtained in this thesis, showed that magnetic hyperthermia had an important effect in the modulation of the extracellular matrix, as well as in the induction of immune-stimulation mechanisms. Phenomenon especially relevant in the search for new therapeutic strategies for pancreatic cancer. Moreover, the experimental results of this thesis showed that the type of cell death pathways triggered by the magnetic hyperthermia treatment depend on the number of intracellular nanoparticles. This is important in the understanding the molecular mechanisms that mediate the cellular response to this thermal therapy.<br /

Aplicaciones fotónicas de nanomateriales de oro en el desarrollo de biosensores enzimáticos e inmunológicos

El objetivo de esta Tesis Doctoral es la aplicación de las propiedades ópticas de los nanomateriales de oro en el desarrollo de biosensores fotónicos para la determinación de biomarcadores clínicamente relevantes. Durante este trabajo, se han sintetizado, caracterizado e implementado varios nanomateriales de oro en diferentes esquemas de biodetección utilizando tanto enzimas como anticuerpos como elementos de reconocimiento biológico. De hecho, fue posible desarrollar nuevos esquemas de nanobiodetección con mejores características analíticas que las tradicionales, como sensibilidad mejorada y adaptabilidad en el punto de atención. En todos los casos, la gran selectividad alcanzada se basó en la selección de receptores biológicos apropiados para cada analito diana y la optimización de su unión orientada al nanomaterial correspondiente. Esto permitió asegurar la transducción más efectiva entre el reconocimiento biológico y los mecanismos fotónicos involucrados en cada caso.En concreto, en esta Tesis se desarrollaron nuevos nanobiosensores enzimáticos utilizando nanoclusters de oro como etiquetas luminiscentes Vis-NIR, evitando los inconvenientes de los fluoróforos convencionales, como la degradación química y la existencia de interferencias espectrales en muestras biológicas. Para ello, se exploraron dos líneas de investigación; a) la unión covalente de nanoclusters de oro cerca del sitio activo de una enzima redox para promover un fenómeno de transferencia de energía que permita la determinación fluorescente de los analitos objetivo, y b) aprovechar la extinción de la fluorescencia de los nanoclusters de oro por oxígeno para monitorear reacciones enzimáticas de la oxidorreductasa.También se propuso el diseño de nanomateriales de oro mediante síntesis dirigida y específica con ligandos de reconocimiento biológico (enzimas) para explorar dos conceptos sensoriales diferentes impulsados por NP-sintéticos: a) la síntesis in-situ de nanomateriales de oro mediante la reducción de residuos de la enzima yb) la formación de nanopartículas de oro aprovechando las propiedades redox de la enzima desencadenadas por su interacción con el sustrato. En todos los casos, la señal óptica del nanomaterial generado está relacionada con la concentración del analito objetivo.Finalmente, esta Tesis también ha explorado el desarrollo de inmuno-nanobiosensores plasmónicos fototérmicos, basados en el uso de nanoprismas de oro unidos a anticuerpos que pueden actuar como transductores fisicoquímicos del reconocimiento biológico del analito generando una señal térmica cuantificable. El uso de nanoprismas de oro como etiquetas térmicas se implementó en esquemas de biodetección comúnmente utilizados y, por lo tanto, bien aceptados en la clínica (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay y LFIA: lateral flow immunoassay). Esto permitió desarrollar un novedoso concepto térmico de estos esquemas tradicionales de biosensores (Thermo-LISA y Thermo-LFIA) no solo con mejores características analíticas sino también con posibilidades reales de transferencia al mercado en el corto-medio plazo.La optimización y evaluación de la respuesta analítica de los nanobiosensores desarrollados, ha permitido la determinación cuantitativa de analitos relevantes para la detección de cáncer (biomarcadores de cáncer gastrointestinal y de próstata), control de calidad de alimentos (aminas biogénicas) y para otras aplicaciones biomédicas como la determinación de neurotransmisores (acetilcolina) y aminoácidos (L-fenilalanina) relacionados con enfermedades específicas.The aim of this PhD Thesis is the application of the optical properties of gold nanomaterials in the development of photonic biosensors for the determination of clinically relevant biomarkers. During this work, various gold nanomaterials have been synthetized, characterized and implemented in different biosensing schemes using both enzymes and antibodies as biological recognition elements. In fact, it was possible to develop novel nanobiosensing schemes with better analytical characteristics than the traditional ones, such as improved sensitivity and point-of-care adaptability. In all cases, the great selectivity reached was based on the selection of appropriate biological receptors for each target analyte and the optimization of their oriented binding to the corresponding nanomaterial. This allowed ensuring the most effective transduction between the biological recognition and the photonic mechanisms involved in each case. In particular, in this Thesis, new enzymatic nanobiosensors were developed using gold nanoclusters as Vis-NIR luminescent labels, avoiding the drawbacks of conventional fluorophores, such as chemical degradation and the existence of spectral interferences in biological samples. For this, two lines of research were explored; a) the covalent binding of gold nanoclusters close to the active site of a redox enzyme to promote an energy transfer phenomena that allow the fluorescent determination of the target analytes, and b) to take advantage of the quenching of gold nanoclusters fluorescence by oxygen to monitor oxidoreductase enzymatic reactions. The design of gold nanomaterials by means of directed and specific synthesis with biological recognition ligands (enzymes) was also proposed to explore two different NP-synthetic driven sensory concepts: a) the in-situ synthesis of gold nanomaterials by means of the reducing residues of the enzyme and b) the formation of gold nanoparticles taking advantage of the redox properties of the enzyme triggered by its interaction with the substrate. In all cases, the optical signal of the generated nanomaterial is related to the concentration of the target analyte. Finally, this Thesis has also explored the development of photothermal plasmonic immuno-nanobiosensors, based on the use of gold nanoprism bound to antibodies which can act as physicochemical transducers of the biological recognition of the analyte generating a quantifiable thermal signal. The use of gold nanoprism as thermal labels was implemented in biosensing schemes commonly used and therefore well accepted in the clinic (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, and LFIA: lateral flow immunoassay). This allowed the development of a novel thermal-based concept of these traditional biosensing schemes (Thermo-LISA and Thermo-LFIA) with not only better analytical characteristics but also with real possibilities of transference to the market in the short-medium term. The optimization and the evaluation of the analytical response of the developed nanobiosensors, has allowed the quantitative determination of relevant analytes for cancer detection (gastrointestinal and prostate cancer biomarkers), control food quality (biogenic amines) and for other biomedical applications such as the determination of neurotransmitters (acetylcholine), and amino acids (L-phenylalanine) related to specific diseases.<br /

Estabilización de Penicilina G acilasa por inmovilización covalente multipuntual dirigida. Mutagénesis de la superficie de la enzima para mejorar la complementariedad enzima-soporte activado

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 09-06-2006A new strategy to achieve a vety high stabilization of industrial enzymes is here proposed. A vety intense ngidification of a given region of the enzyme surface via its improved multipoint covalent immobilization on activated preexisting supports has been developed. The main objective of this Ph.D. Thesis involves the development of five different relevant subobjedwes: a.- Preparation of tailor made disulfideepoxy supports containing i)- a small concentration of highly reactive disulfide groups able to selectively immobilize enzyme through inserted cysteine groups, ii).- a very high concentration of epoxy groups able to perfom an intense multipoint immobilization with nucleophilic groups of the enzyme surface placed in the vicinity of the inserted cysteine group. Furthermore. the optimization of multipoint covalent immobilization of enzymes on these new supports was also studied. b.- Preparation of different mutated enzyme containing, each mutant, a reactive cysteine group placed in regions that are naturally rich in lysine residues. The tridimensional structure of PGA was studied and diierent mutations (insertion of cysteines) were proposed. The theoretical structure of the proposed mutants was evaluated and those mutants (with very similar structure with regards to the native one) were cloned. expressed and purified. c.- Site-direct multipoint covalent attachment of each mutated enzyme in order to detect the region of the enzyme surface that is more sensitive for stabilization (in this case a region close to the active site and surrounding the amino acid 8380 of the enzyme) d.- Enrichment of the selected region of the enzyme surface with new lysine residues (up to 8 new lysine groups were inserted close the amino acid 8380). In this way. a highly impmved ngidification of this region of the enzyme by multipoint covalent irnmobilization couM be achieved. e.- Evaluation of dfferent activated supports in order to get the most intense directed multipoint covalent irnmobilization of the mutated enzyme and subsequently the best stabilization factors. Glyoxyi agarose selectwely immobilues the enzyme via this mutated region of its surface (enriched with adiiional lysine residues) and this support promotes the more intense stabilization ((around 20 lysine residues of the enzyme surface seem to be imrolved in this very interesting multipoint covalent immobilization). The best immobilized derivatives were more than 300.000 fold more stable than the corresponding soluble (and one-point immobilized) enzyme in experiments of irreversible thermal inactivarion. This dramatic stabilization was not found in scientific literature for any anzyme and any stabilzation strategy. Similar stabilization factors were found for inactivation of the enzyme in the pregence of organic cowlvents. In addition to that, these highly r i g i i i enzymes exhibit W r ca talytic properae9 for interesüng biotransfomiaoons (enant¡o&dh hydmlysm of chiral esters, kimatically wntrolled synthesis c4 amide bonds). Furlhermore, very intense mulüpoint immobiliit'mn of the best mutated enzyme was performed under distorting experimental condtimns in order to " n g i d i i inconect enzyme stnictures with altered functional propeftb. In ths way, soma derivatives with hiihly improved propeities for kinetically controlled synthesis of antiobitcs were obtained

Enzima penicilina G acilasa mutada inmovilizada y estabilizada, procedimiento de obtención y sus aplicaciones

Fecha de solicitud: 06/12/2007.- Titular: Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)The present invention describes different PGA enzyme mutants prepared by inserting one (1) Cys (in each mutant) in a different region of the surface of the enzyme which was relatively rich in lysine residues as well as immobilized forms on disulphide/epoxide supports and with additional mutations which increase their stability with respect to the effect of heat and organic solvents (300,000 times more stable than the corresponding soluble enzyme). The excellent stability of these enzymatic derivatives makes them very useful for catalysing different industrial processes of interest in organic and pharmaceutical chemistry: hydrolysis of penicillin, synthesis reactions in the presence or absence of solvents and enantioselective hydrolysis and synthesis reactions.La presente invención describe los diferentes mutantes de la enzima de PGA preparados insertando un (1) Cys (en cada uno mutante) en una diferente región de la superficie de la enzima que era relativamente rica en restos de lisina así como las formas inmovilizadas en soportes del disulfuro/del epoxide y con las mutaciones adicionales que aumento su estabilidad con respecto al efecto del calor y a los disolventes orgánicos (300.000 estables más muchos de la tiempo que la enzima correspondiente del soluble). La estabilidad excelente de estos derivados enzimáticos los hace muy útiles para catalizar diferentes procesos industriales del interés en química orgánica y farmacéutica: hidrólisis de la penicilina, reacciones de síntesis en la presencia o ausencia de disolvente y hidrólisis y reacciones de síntesis enantioselective.Peer reviewe